LAPORAN PRAKTIKUM
ACARA 3
OLEH
NAMA :
BEATRICE RUTH BATUBARA
NIM : 0110740064
ASITEN :
NELLY UYO
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT
UNIVERSITAS CENDERAWASIH
JAYAPURA
2012
BAB
I
PENDAHULUAN
A. Latar
Belakang
Mikroba seperi makhluk
hidup lainnya memerlukan nutrisi pertumbuhan. Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan ini akan membantu di dalam mengkultivasi,
mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba. Mikroba memiliki karakteristik dan
ciri yang berbeda-beda di dalam persyaratan pertumbuhannya.
Ada mikroba yang bisa hidup hanya pada media yang mengandung sulfur dan ada pula yang tidak mampu hidup dan seterusnya. Karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroba inilah yang menyebabkan bermacam-macamnya media penunjang pertumbuhan mikroba.
Ada mikroba yang bisa hidup hanya pada media yang mengandung sulfur dan ada pula yang tidak mampu hidup dan seterusnya. Karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroba inilah yang menyebabkan bermacam-macamnya media penunjang pertumbuhan mikroba.
Untuk menumbuhkan dan
mengembangbiakan mikroba, diperlukan suatu substrat yang disebut media.
Keragaman yang luas dalam hal tipe nutrisi di antara mikroba diimbangi
tersedianya berbagai media yang banyak macamnya untuk kultivas
Media
berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji
sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba, dimana dalam proses
pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk
menghindari kontaminasi pada media.
B. Tujuan
Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Nutrient
Agar dan Potato Dextrose Agar
BAB
II
TINJAUAN
PUSTAKA
Pengertian dan Fungsi
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan
yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan
mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa
molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media
pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga
memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
Bahan-bahan media pertumbuhan
1. Bahan dasar
Ø air (H2O) sebagai pelarut
Ø agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk
pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan
mencair pada suhu 45 oC.
Ø gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti
agar. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen.
Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya
dibanding agar.
Ø Silica gel, yaitu bahan yang
mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel
khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan
untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur
mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/trace element.
Ø Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh
berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad
heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat,
lemak, protein dan asam organik.
Ø Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau
senyawa bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik
seperti urea.
Ø Vitamin-vitamin.
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke
medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator
asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam
organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan
mikroba non-target/kontaminan.
4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
Ø Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan,
granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya
adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw
& Walther Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar
tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan
pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan
kekuatan agar, terutama pada pH yang asam
Ø Peptone, peptone adalah produk
hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein,
lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya
dan bagaimana cara memperolehnya.
Ø Meat extract. Meat extract
mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi.
Ø Yeast extract. Yeast extract
terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract
mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex).
Ø Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya
pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya
digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.
Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
Macam-Macam Media Pertumbuhan
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Ø Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15%
sehingga setelah dingin media menjadi padat..
Ø Medium setengah padat yaitu media yang mengandung
agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair.
Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar
ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang.
Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol
Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan
media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid
juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate
Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme
nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Ø Medium cair yaitu media yang tidak mengandung
agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
2. Medium berdasarkan komposisi
Ø Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat
kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar,
Mac Conkey Agar.
Ø Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian
komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar)
yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak
kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa
penyusunnya.
Ø Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan
komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung
diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart
Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Ø Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk
pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Ø Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah
suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba
lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria
Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten
antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth
yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang
toleran terhadap garam.
Ø Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung
komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti
darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk
mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya
membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan
komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar,
dll.
Ø Media untuk peremajaan kultur
Media umum atau spesifik yang digunakan untuk
peremajaan kultur
Ø Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau
menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate
medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat
sebagai sumber karbon.
Ø Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan
spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan
adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth,
Arginine Agar.
Ø Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba
dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media
diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih
Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna
media di sekeliling koloni.
Sifat Media
Penggunaan media bukan hanya umtuk pertumbuhan dan
perkembangbiakan mikroba tetapi juga untuk tujuan isolasi, seleksi, evaluasi
dan diferensiasi sehingga setiap media mempunyai spesifikasi sesuai dengan
maksudnya. Berdasarkan sifatnya, media dibedakan menjadi :
- Media Umum yaitu media yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan satu atau lebih kelompok mikroba secara umum misalnya : agar kaldu nutrisi untuk bakteri, agar kentang dekstrosa untuk jamur
- Media Pengaya yaitu media dimana suatu jenis mikroba diberi kesempatan untuk tumbuh dan berkembang lebih cepat dari jenis lainnya yang sama-sama berada dalam satu media. Misalnya: kaldu selenit atau kaldu tetrationet untuk memisahkan Salmonella typhi dari mikroba lain yang ada dalam feses
- Media Selektif yaitu media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau lebih jenis mikroba tertentu tetapi akan menghambat atau mematikan kenis-jenis lainnya. Misalnya : media SS (Salmonella-Shigella) agar untuk menumbuhkan Salmonella dan Shigella.
- Media Diferensial yaitu media yang dipergunakan untuk penumbuhan mikroba tertentu serta penentuan sifat-sifatnya seperti media agar darah untuk penumbuhan bakteri hemolitik
- Media Penguji yaitu media yang dipergunakan untuk pengujian senyawa tertentu dengan bantuan mikroba. Misalnya : media penguji vitamin, antibiotika, residu pestisida
Metode Kultivasi Mikroba
Populasi mikroba di alam sangat besar dan kompleks.
Alam sekitar baik udara, tanah, air juga dihuni oleh mikroba. Penelitian
mikroba dalam berbagai habitat memerlukan tehnik untuk memisahkan populasi
campuran atau biakan campuran yang rumit ini menjadi spesies yang berbeda-beda
sebagi biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang semuanya
berasal dari satu sel induk. Proses isolasi dan upaya mempertahankan keadaan
murni memerlukan tehnik aseptik. Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut
inokulum. Dengan menginokulasikan medium dengan tehnik goresan yaitu
menggoreskan inokulum diatas media menggunakan oase, sel-sel itu akan
terpisah-pisah sendiri. Setelah inkubasi sel-sel mikroba memperbanyak diri dan
dalam waktu 18-24 jam terbentuk massa sel yang disebut : koloni. Piaraan murni
yang disimpan lama mudah sekali mengalami mutasi. Jika terjadi demikian, maka
piaraan murni tersebut bukan lagi piaraan murni semula. Ini berarti tipe asli
telah hilang. Untuk menghindarkan atau paling sedikit mengurangi terjadinya
mutasi dalam piaraan simpanan, maka :
- Secara periodik piaraan harus dipindahkan kemedium baru. Pemindahan ini sebaiknya dilakukan pada koloni mencapai fase log
- Piaraan harus disimpan pada suhu rendah dan terhindar dari radiasi
- Mikroba diliofilisasikan yaitu dimasukan dalam ampul berisi susu kering bercampur CO2 kemusian disimpan pada tempat bersuhu rendah
Sesungguhnya kebanykan
laboratorium mikrobiologi menyimpan dan memelihara koleksi biakan tersebut. The
American Type Culture Collection yang ada di Washington memelihara ribuan
spesies mikroba termasuk virus.
Karakteristik Biakan
Bakteri
Karakteristik pertumbuhan bakteri dalam medium
pertumbuhan menunjukan morfologi, mekanisme pembelahan dan aktivitas
metabolismenya. Pertumbuhan bakteri dalam medium cair dapat membentuk endapan,
polikel atau tampak keruh. Pertumbuhan membentuk endapan menunjukan sel bakteri
membentuk agregat sehingga menjadi berat kemudian mengendap, misalnya Staphylococcus
aureus . Pertumbuhan yang membentuk polikel disebabkan bakteri tersebut
memiliki pili atau glikokaliks yang menyebabkan sel yang satu melekat dengan
yang lain, misalnya Mycobacterium phlei. Pertumbuhan yang menampakan
kekeruhan menunjukan bahwa bakteri yang tumbuh tersebar merata dan biasanya
bakterinya bersifat motil. Bila mikroba ditumbuhkan pada medium padat akan
menunjukan koloni yang khas sehingga dapat dipakai untuk mengidentifikasi
mikroba yang tumbuh tersebut.
1. Keanekaragaman
Mikroorganisme dalam Media Pemeliharaan
Mikroorganisme merupakan istilah yang digunakan
untuk menyebut organisme berukuran mikroskopis, seperti bakteri, sianobakter, kapang
mikroskopis, protozoa dan lain sebagainya. Bakteri merupakan salah satu
organisme uniseluler berukuran kecil yang termasuk golongan prokariotik.
Sel-sel bakteri sangat khas dengan berbagai bentuk, seperti bulat, batang, oval
dan spiral. Bakteri memiliki diameter 0,5-1,0 μm dan panjang 1,5-2,5 μm,
sehingga tidak bisa diamati tanpa bantuan mikroskop. Alongi dalam Feliatra
(2001) menyatakan bahwa bakteri terdapat hampir di seluruh ekosistem dan
bertanggung jawab untuk mendegradasi dan mendaur ulang unsur atau elemen
esensial, sehingga bakteri menjadi salah satu organisme utama dalam suatu
ekosistem.
Bakteri mudah ditemukan di air, udara dan tanah.
Mereka hidup dalam suatu koloni, baik bersimbiose, bebas ataupun parasit pada
makhluk hidup. Jumlah bakteri di alam sangat melimpah dengan keragaman yang
sangat tinggi (Pelczar dan Chan, 2005). Untuk mempelajari kehidupan dan
keragaman bakteri, diperlukan suatu usaha untuk mengembakbiakkan mereka dalam
skala laboratorium. Pengembangbiakan ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri
dari sumber isolat, seperti tanah, udara, sisa makanan, dll, dalam media yang
mengandung nutrisi.
Media pertumbuhan bakteri sangat beragam, mulai
dari media selektif, media penyubur, media diferensial, dll. Masing-masing
media memiliki fungsi berbeda dan digunakan tergantung tujuan dari praktikan.
Berikut adalah syarat yang harus dipenuhi media :
a. Mengandung
nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme yang sedang
dikembangkan.
b. Memiliki
kelembaban optimum bagi pertumbuhan mikroorganisme.
c. Mengandung
oksigen (kultur bakteri aerob) dan pH yang sesuai.
d. Harus
bebas dari mikroba lain dan steril
Ada 3 jenis media pengembangbiakan berdasarkan
konsistensinya, antara lain :
a. media
padat, yaitu media berbentuk padat yang mengandung agar 1-1.5%, misalnya
nutrien agar
b. media
cair, yaitu media berbentuk cair yang tidak mengandung agar, misalnya nutrien
broth.
c. media
semi padat, yaitu media yang berbentuk padat pada suhu dingin, dan berbentuk
cir bila suhu panas, misalnya media SIM (media yang digunakan untuk uji
produksi sulfur, indol, motilitas)
Berdasarkan komposisi penyusunnya, media
dibedakan menjadi 2, yaitu media sintetis dan media non-sintetis. Media
sintetis adalah media yang telah diketahui susunan kimia nutrisinya, seperti
media pepton agar yang terbuat dari pepton, agar dan NaCl, sedangkan media
non-sintetis, yaitu media yang belum diketahui susunan kimia nutrisinya,
seperti kentang, wortel, kaldu, dll.
2. Pembiakkan
Mikroorganisme (Bakteri)
Dalam dunia mikrobiologi, dikenal beberapa
istilah seperti inokulasi, kultur dan isolasi. Inokulasi adalah suatu usaha
menumbuhkan mikroorganisme dari satu sumber ke media pertumbuhan steril. Biakan
yang tumbuh disebut dengan kultur. Isolat adalah biakan murni dari
mikroorgansime yang diharapkan berasal dari satu jenis, sedangkan isolasi
adalah usaha untuk mendapatkan isolat.
Sumber isolasi → Inokulasi → Kultur/biakan →
Isolasi → Isolat
Tahapan
sederhana dalam mengidentifikasi bakteri, yaitu :
1.
Menumbuhkan mikroorganisme dalam media sintetik cawan petri
2.
Koloni yang tumbuh pada tahap 1 merupakan koloni campuran, sehingga perlu tahap
lanjut.
3.
Koloni yang benar-benar terpisah dari suatu kultur campuran dikarakterisasi
tipe pertumbuhan (karakterisasi
makroskopis) kemudian diisolasi murni pada media miring (slant agar) dalam tabung reaksi.
4.
Identifikasi dilanjutkan hingga tingkat mikroskopis berdasarkan sifat-sifat
tertentu yang tercantum dalam Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology
Dalam
mengembangbiakkan mikroorganisme, khususnya bakteri, alat-alat yang digunakan
harus steril. Sterilisasi dilakukan dengan memanaskan seluruh alat, seperti
cawan petri, ose, tabung reaksi, dll di dalam autoclave. Sebenarnya,
sterilisasi adalah masalah teknis yang terkdang tidak ditemukan dalam literatur.
bahkan, informasi mengenai cara sterilisasi saya dapatkan dari kakak angkatan,
laboran dan rekan sekerja di lab. Oleh karena itu, sebaiknya mahasiswa memiliki
koneksi dengan salah satu dari mereka, sehingga mendapatkan informasi yang
sangat penting apabila ingin bekerja di laboratorium, khususnya mikrobiologi.
Sterilisasi dilakukan pada suhu 121oC, tekanan 1 atm dan dilakukan selama 15
menit. Ini dilakukan gar sel-sel vegetatif bakteri mati, sehingga dapat
menurunkan resiko kontaminasi. Sterilisasi juga menjadi syarat utama untuk
bekerja di laboratorium.
autoclave di laboratorium mikrobiologi UNY
Membiakkan bakteri dapat dilakukan dengan berbagi
cara, salah satunya pengembangbiakan dalam media cawan petri. Pengembangbiakan
dalam cawan ini ada beberapa metode, yaitu :
1. Metode cawan
gores (streak plate)
Metode cawan gores cukup sulit bagi pemula,
terutama mahasiswa semester awal yang baru mengambil mata praktikum
mikrobiologi. Kesulitan dari metode ini, yaitu proses penggoresan yang cukup
lama dan sulit, sehingga memudahkan terjadinya kontaminasi dan kegagalan.
Prinsip metode ini, yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari
koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi.
Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri
menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber
isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril.
Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal di satu sisi cawan.
Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakAn
untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. Langkah ini
dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.
Pada metode ini, goresan di sisi pertama
diharapkan koloni tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi
kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga
didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap
hendaknya dilakukan secara aseptik agar tak terjadi kontaminasi.
2. Metode cawan
tuang (pour plate)
Metode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena
tidak membutuhkan keterampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik.
Metode ini dilakukan dengan mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui
beratnya ke dalam 9 ml garam fisiologis (NaCl 0.85%) atau larutan buffer
fosfat. Larutan ini berperan sebagi penyangga pH agar sel bakteri tidak rusak
akibat menurunnya pH lingkungan. Pengenceran dapat dilakukan beberapa kali agar
biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhu cawan (biakan terlalu
padat akan mengganggu pengamatan).
Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan
petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (nutrien agar)
steril hangat (40-50oC) kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator
(37oC) selama 1-2 hari.
Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi
steril agar tidak terjdi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang
tidak diinginkan (di laboratorium, kontaminasi biasanya terjadi akibat
tumbuhnya kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang
hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan (media
panas sebabkan tangan jadi panas juga), media panas masih mengeluarkan uap yang
akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. pada
metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik,
dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam
inkubator
3. Metode cawan
sebar (spread plate)
Pada metode cawan sebar, 0.1 ml suspensi bakteri
yang telah diencerkan (metode 3) disebar pada media penyubur steril yang telah
disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan dengan batang drygalski
agar koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian diletakkan
dalam inkubator (37oC) selama 1-2 hari. Metode ini cukup sulit terutama saat
meratakan suspensi dengan batang drygalski. Alih-alih koloni tumbuh merata,
biakan justru terkontaminasi. Oleh karena itu, batang drygalski harus
benar-benar steril, yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu dalam alkohol
kemudian dipanaskan dengan api bunsen. Perlu diingat, batang drygalski, yang
masih panas akibat pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar,
sehingga harus didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya di sekitar api
bunsen (±15 cm).
Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh
dan berkembang menjadi satu koloni bakteri. Satu koloni bakteri yang terpisah
dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media,
diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan
permukaan koloni.
Koloni yang tumbuh terpisah ditumbuhkan kembali
untuk mendapatkan isolat murni. Isolasi murni dilakukan dengan mengoleskan ose
steril pada koloni dalam kultur campuran yang benar-benar terpisah satu sama
lain. Olesan tersebut digores pada media padat agar miring dalam tabung reaksi.
Koloni yang tumbuh dalam media ini merupakan
isolat murni, yang hanya berasal dari satu jenis bakteri saja. Koloni yang
tumbuh dapat dikarakerisasi berdasarkan tipe pertumbuhannya pada media agar
miring.
Seluruh kultivasi atau penanaman sebaiknya
dilakukan di dalam laminar air flow yang tertutup, untuk mengurangi resiko
kontaminasi. LAF dilengkapi dengan lampu fluorescent, sinar UV dan kipas angin.
Lampu fluorescent digunakan apabila kondisi cahaya di dalam LAF dan kamar
isolasi kurang memadai. Sinar UV bersifat germisida yang dapat membunuh bakteri
yang tidak diinginkan, sehingga dapat menurunkan resiko kontaminasi. Sebelum
penanaman (kultivasi), alat2 yang digunakan sebaiknya dikenai sinar UV selama 5
menit (ingat, hanya alat2, seperti lampu bunsen, ose, pipet, dll).
laminar air flow di laboratorium mikrobiologi UNY
3. Karakterisasi
Mikroskopis dan Identifikasi
Karakterisasi merupakan langkah awal dalam
mengidentifikasi bakteri. Karakterisasi dilakukan untuk mendapatkan ciri khas
dari isolat, sehingga dapat diketahui jenisnya. Karakterisasi bakteri dilakukan
melalui dua tahap, yaitu karakterisasi makroskopis, meliputi tipe pertumbuhan
pada berbagai media dan karakterisasi mikroskopis, yaitu karakterisasi bentuk
sel, ukuran, dsb.
BAB
III
PROSEDUR KERJA
PROSEDUR KERJA
Alat dan
Bahan
Alat :
·
Hot Plate
·
Timbangan Analitik
·
Kater
·
Cawan Petri
·
Bayang Pengaduk
·
Gelas Erlenmeyer
·
Autoklaf
·
Gelas beker (Beaker
Glass)
Bahan :
·
Kentang
·
Agar-agar
·
Akuades
Pembuatan
Nutrient Agar dan Nutrient Broth
Ø Pembuatan Nutrient Agar
· Timbang komponen medium dengan
menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan
komposisi berikut:
§ Beef extract 3 g
§ Peptone 5 g
§ Agar 15 g
§ Akuades s.d 1000 ml
· Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu
bagian untuk melarutkan Beef extract dan peptone dan
sebagian lagi untuk melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih
banyak
·
Larutkan agar pada
sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan diberi panas. Dapat
menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat,
karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah).
·
Sementara itu sebagian
akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef extract,
cukup dengan pengadukan.
· Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke
larutan agar dan diaduk sampai homogen. Kemudian pH media diukur dengan
mencelupkan kertas pH indikator. Jika pH tidak netral maka dapat ditambahkan
HCl/NaOH.
· Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu
Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf.
· Tuang media steril ke cawan petri steril secara
aseptis. Jika diinginkan media tegak atau miring pada point ke 5, media langsung
dituang ke tabung kemudian disterilisasi.
Ø Pembuatan Nutrient Broth
Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak
memakai agar sebagai pemadat. Proses pembuatannyapun lebih sederhana, tinggal
melarutkan peptone dan beef extract kemudian ditampung dalam labu
Erlenmeyer atau tabung reaksi dan siap disterilisasi. Proses pembuatan ini
tidak memerlukan panas, peptone dan beef extract akan mudah larut
sempurna pada air suhu kamar jika diaduk.
Pembuatan Potato Dextrose Agar
(PDA)
· Timbang komponen media dengan menggunakan
timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi
berikut:
§ Potato/kentang 3 g
§ Peptone 5 g
§ Agar 15 g
§ Akuades s.d 1000 ml
§
(sebelum ditimbang, sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil)
· Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama
1-3 jam sampai lunak, kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan
memerasnya menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beaker glass
baru.
·
Agar dilarutkan dengan Hot
Plate Stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah larut dapat ditambahkan
dekstrosa dan dihomogenkan lagi.
· Setelah semua larut, ekstrak kentang dan
agar-dekstrosa dicampur dan dihomogenkan. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.
· Media dituang ke
dalam Erlenmeyer atau ke
tabung reaksi kemudian siap untuk disterilisasi.
BAB
IV
HASIL
DAN PEMBAHASAN
Cara membuat media pertumbuhan Nutrient Agar
dan Potato Dextrose Agar antara lain :
1. Pertama menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan
2. Lalu kupas kulit kentang dan potong-potong menjadi
seperti dadu.
3. Kemudian cuci bersih dengan air.
4. Tiriskan di atas tisu kering hingga kentang menjadi
kering.
5. Timbang kentang dengan timbangan analitik hingga
menjadi 1,6 gram.
6. Lalu timbang Pepton menjadi 1 gram dan Agar menjadi
3 gram.
7. Siapkan aquades di dalam gelas beker (beaker
glass) dengan volume 200 ml.
8. Masukkan kentang ke dalam aquades dan panaskan hingga
mendidih dengan hot plate. Gunakan batang pengaduk untuk mempercepat proses
ini.
9. Setelah mendidih saring dengan saringan dan
tuangkan di dalam beaker glass yang lain
10. Masukkan Pepton
dan Agar, lalu panaskan lagi di atas hot plate dan aduk dengan btang
pengaduk hingga larutan menjadi homogen.
11. Setelah semua larut, atur pH media hingga menjadi
5-6 dengan meneteskan HCL atau NaOH
.
12. Pindahkan ke dalam Erlenmeyer, tutup dengan kapas dan aluminium foil dan
sterillisasikan dengan autoklaf.
BAB
V
KESIMPULAN
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan
yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan
mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media
berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan
media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni
dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
Media pertumbuhan dapat dibuat dengan bantuan manusia yaitu contohnya
dengan nutrient agar dan nutrient Dextrose Agar.
DAFTAR
PUSTAKA
0 comments:
Post a Comment